Glauben, Reformation und Aufstände waren seit Luthers Thesenveröffentlichung und dem Wormser Reichstag von 1521 die dominierenden Themen der Innenpolitik. Vor diesem Hintergrund versammelte sich der Reichstag des Jahres 1526 zum ersten Mal in Speyer. Wie in allen gastgebenden Städten forderten die Unterbringung und Verköstigung mehrerer tausend Gäste – allein der Kurfürst von Sachsen reiste mit 700 Personen und 400 Pferden an – Rat, Einwohner und Wirte heraus. Andererseits bedeuteten solche Veranstaltungen für eine Stadt beträchtliche Einnahmen.
Nach der prunkvollen Eröffnung am 25. Juni 1526 mit Prozession der Fürsten und Abgesandten zum Dom und feierlichem Hochamt und zwei Monaten mit Beratungen und Disputen fällte der Reichstag zwei Beschlüsse abseits der großen Themen, die aber für die Reichsstadt von großer Bedeutung waren: Reichsregiment und Reichskammergericht, neben dem Kaiser die obersten Repräsentanten staatlicher Macht, wurden 1527 nach Speyer verlegt.
Die drängende Glaubensfrage blieb dagegen weiterhin ungelöst. Die unklare Resolution des Reichstages, dass jeder Stand sich so verhalten solle, wie er es vor Gott und dem Kaiser verantworten könne, begünstigte die Ausbreitung von Luthers Lehren.
1529 versammelte sich der Reichstag ein weiteres Mal in Speyer (Reichstag zu Speyer 1529). Der Streit um Glauben, Gewissen und Gehorsam entzweite die Reichsstände. Mehrheitlich fiel am 19. April der Entscheid, den Beschluss des letzten Reichstages (1526) aufzuheben und die Gültigkeit des Wormser Ediktes von 1521 (Reichstag zu Worms 1521) zu bestätigen, welches über Luther und seine Anhänger die Reichsacht verhängt hatte.
Die am Reichstag teilnehmenden evangelischen Fürsten und Reichsstädte waren über diesen Beschluss empört und verfassten am 20. April 1529 ein Protestschreiben, dessen Annahme vom Reichstag verweigert und daraufhin Kaiser Karl V. übersandt wurde. Mit der gegen den Reichstagsbeschluss gerichteten Protestation zu Speyer der evangelischen Fürsten ging ein weltgeschichtlich bedeutsames Ereignis von Speyer aus: die Trennung der christlichen Kirche West-Europas war besiegelt. Die Protestation der Fürsten und Städte gilt als Geburtsstunde des Protestantismus und seit diesem Reichstag nannte man die Anhänger der reformatorischen Bewegung Protestanten.
Die Stadt selbst neigte dem Luthertum zu und der Rat gründete 1538 in Konkurrenz zur Domschule des Bischofs eine lutherisch geführte Ratsschule. Das endgültige Bekenntnis zum Luthertum durch die Stadt erfolgte 1540. Diese Entscheidung wirkte noch lange nach. So wurde noch 1698 beim Wiederaufbau nach dem Pfälzischen Erbfolgekrieg nur die Ansiedlung von Protestanten gestattet.
Ein Bauwerk, das an diesen Teil der Geschichte Speyer erinnert, ist die Gedächtniskirche.
